酒酒球菌因为其高效的苹果酸-乳酸发酵能力及胁迫环境适应性通常作为葡萄酒商业发酵菌株。工业生产过程中葡萄酒酸胁迫环境仍是限制酒酒球菌生长及高效完成苹果酸-乳酸发酵的重要胁迫因素。因此寻找对酸胁迫环境具有较好耐受性的酒酒球菌突变株并探究提升酒酒球菌酸胁迫耐受能力的关键基因资源具有重要意义。本研究团队前期通过定向进化和比较基因组学技术鉴定到酒酒球菌二元信号转导响应调节因子orf00404可能在增强酒酒球菌酸胁迫耐受性方面具有重要功能。本研究利用基因重组技术将酒酒球菌二元信号转导响应调节因子编码基因orf00404在植物乳杆菌WCFSI中异源表达，结果表明异源表达orf00404可显著增强植物乳杆菌WCFSI在酸胁迫条件下的生长速度。根据生长曲线结果选取酸胁迫条件下生长60h,72h,108h的对照菌株和重组菌株样品进行转录组实验，发现重组菌株在这3个时间点上相较于对照菌株差异基因表达数分别为1562个，641个，748个。3个时间点上重组菌株较对照菌株显著上调表达和下调表达的基因数分别为20个（例如群体感应类二元信号转导系统操纵子编码基因lamA-D，RNA聚合酶结合蛋白编码基因spx5，天冬氨酸代谢相关基因，钾离子转运蛋白编码基因，腺嘌呤脱氨酶编码基因等）和47个（例如热激蛋白编码基因hsp1，硫氧还蛋白编码基因trxA1，DNA损伤修复相关蛋白编码基因dinP，mutY，umuC，uvrB等）。膜流动性、膜通透性、膜完整性检测实验表明重组菌株在对数生长早期（72h）时较对照菌株具有更强的膜流动性、膜通透性和膜完整性。胞内ATP含量检测实验表明重组菌株在对数生长初期（60h）较对照菌株胞内ATP含量显著减少，说明此时重组菌株较对照菌株消耗ATP含量更大。H⁺-ATPase活性检测实验表明重组菌株在对数生长晚期（108h）H⁺-ATPase活性显著低于对照菌株。综上所述，植物乳杆菌中异源表达酒酒球菌二元信号转导响应调节因子orf00404可以通过调控重组菌株基因表达模式，增加其对数初期的ATP消耗量，增强其对数早期的细胞膜流动性、膜通透性和膜完整性等方式显著增强植物乳杆菌WCFS1酸胁迫耐受性。

在本研究中，来自O. oeni SD-2a的orf00404基因，编码一个双组分信号转导系统响应转录调节因子，被异源性表达在L. plantarum WCFS1中。生长曲线、转录组学、生理学和生化分析表明，orf00404调节基因表达模式，增加ATP消耗，并在初始对数阶段增强重组L. plantarum菌株的细胞膜流动性、通透性和完整性，以提高酸性应激耐受性。本研究指出了orf00404在酸性应激条件下的功能作用，暗示了orf00404在微生物生物技术产业中的潜在应用。

图1  WCFS1(pIB184-vector)和WCFS1(pIB184-orf00404)在pH 3.8 (A)、pH 4.0 (B)、pH 4.2 (C)和pH 6.4 (D)条件下在MRS培养基中的生长曲线

图2 在pH 4.0条件下培养60小时(A)、72小时(B)和108小时(C)后，重组菌株WCFS1 (pIB184-orf00404)与对照菌株WCFS1 (pIB184-vector)

基因表达差异的火山图

论文发表于《BMC Microbiology》。 《BMC Microbiology》是BMC系列期刊之一，专注于微生物学领域的研究，涵盖细菌、病毒、真菌等微生物的基础与应用研究。该期刊位于微生物学领域中科院二区，影响因子4.0。论文作者为生物与医药工程学院刘龙祥博士团队，发表时间为2024年9月。